Серологические методы исследования в диагностике паразитарных заболеваний

Серологический анализ крови представляет собой способ лабораторного исследования определенных антигенов или антител (специфических белков) в сыворотке крови пациента, основанный на иммунных реакциях организма. Данный метод применяется при диагностике инфекционных заболеваний для выявления наличия антител в крови больного к определенному виду вирусов или бактерий, а также для определения групповой принадлежности крови.

Исследуемый материал

В первую очередь для проведения серологического анализа используют биологический материал, собранный от пациента:

• сыворотка крови
• слюна
• фекальные массы

В некоторых случаях исследуется материал, выделенный из определённых объектов окружающей среды:

• вода
• почва

Методика проведения анализа или забора крови

Данный анализ не требует специальной подготовки пациента. Забор крови проводится утром натощак и, производится в процедурных кабинетах лечебных учреждений, согласно общепринятым гематологическим методикам. Для серологического исследования забор крови производится двумя методами: венозную кровь забирают из локтевой вены пациента, а капиллярную кровь – из безымянного пальца. Кровь помещают в стерильные герметичные пробирки.

Особенности транспортировки крови и хранения сыворотки

Сразу же после забора крови её транспортируют в специальную лабораторию, где в тот же день производится подготовка сыворотки. Хранение сыворотки допускается не более 4 – 6 дней в холодильной камере при температуре 2 – 4 градусов. При необходимости более длительного хранения, сыворотка замораживается. Во избежание нарушения качества сыворотки допускается однократное её замораживание и, соответственно, размораживание. При длительном хранении антитела теряют свои свойства и становятся частично неактивными, наиболее чувствительными к замораживанию являются иммуноглобулины класса М. После размораживания сыворотки необходимо тщательное перемешивание её до однородной массы, что способствует восстановлению концентрации антител, содержащихся в данной сыворотке.

Для чего используют серологические исследования?

Серологические методы лабораторной диагностики используются для выявления таких заболеваний как эхинококкоз, трихинеллёз, токсокароз, описторхоз, цистицеркоз, токсоплазмоз, амебиаз, лямблиоз, для определения эффективности проведённого курса лечения и, наконец, для обнаружения повторного заболевания после полного выздоровления пациента.

Основные методы серологической диагностики

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Данная реакция является непрямым вариантом серологического исследования, то есть, производится она в два этапа. На первом этапе производят выявление необходимого антитела в циркулирующем комплексе антиген – антитело с помощью антиглобулина, схожего по своей структуре с белками иммунной сыворотки. Выявление искомого антитела возможно также при изучении заранее приготовленного антигенного препарата под люминесцентным микроскопом, без использования антиглобулинов.

Иммунофлюоресцентная реакция – очень трудоёмкий процесс, требующий от специалиста немало времени и ответственности. Начинается реакция с подготовки растворов, затем сыворотки и их контрольные образцы подвергаются титрованию (процесс, позволяющий определить содержание определённого вещества путём постепенного смешивания исследуемого раствора с контролируемым количеством реагента). Подготовленные ранее разведения и их контрольные образцы аккуратно наносятся на предметные стёкла с антигеном. Потом препараты подвергаются инкубации, затем следует их отмывание и высушивание на воздухе. На стёкла с антигеном тонким слоем наносится антисыворотка, после этого производится вторичная инкубация препаратов и, вся предыдущая цепь действий повторяется, завершаясь высушиванием препарата. В результате препарат на предметном стекле подвергается обработке глицерином и исследуется в люминесцентном микроскопе.

Результаты проведённой реакции оцениваются по четырёх бальной шкале, которая характеризуется интенсивностью поверхностного жёлто-зелёного свечения клеток антигенов:
+ очень слабое свечение клетки, заметное только на её периферии
++ слабое свечение периферии клетки, но с явно заметным зелёным оттенком
+++/++++ яркое свечение зелёного цвета периферии клетки
Титром реакции считается такое разведение сыворотки, где не менее 50 % клеток антигена проявляют чёткое поверхностное свечение, то есть результат реакции +++ или ++++. Значение тира реакции от 1/80 до 1/100.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Принцип реакции основывается на способности эритроцитов концентрировать антиген на своей поверхности и склеиваться, образуя видимый осадок, при вступлении в контакт со специфическими антителами. Данная реакция очень информативна в диагностике острой формы описторхоза, острой и хронической формы эхинококкоза и трихинеллёза. Иногда РНГА используется для подтверждения результатов ИФА, что помогает повысить достоверность диагностики паразитарных заболеваний. Набор, необходимый для проведения реакции, содержит: (Д+) эритроциты барана, чувствительные к специфическому антигену, (Д-) эритроциты без антигена, (Э) сухие эритроциты барана, (К+) диагностическую агглютинирующую сыворотку – положительный контрольный тест, (К-) нормальная сыворотка человека – отрицательный тест, реагент, применяемый для подготовки раствора, используемого при разведении сыворотки. Постановка реакции происходит в несколько этапов, строго следующих один за другим. Вначале подготавливают необходимые растворы, затем готовят сыворотки и их контрольные образцы, после чего данные образцы наносятся на планшеты. Далее следует нанесение на планшеты сенсибилизированных (Д+) и несенсибилизированных (Д-) эритроцитов барана. Данные препараты инкубируются, и через некоторое время производится учёт результатов. Результаты проведённой реакции учитываются по четырёх бальной системе.

Интенсивность реакции зависит от количества осаждённых эритроцитов на дне образованных лунок:
– отрицательная реакция, которая характеризуется осаждением эритроцитов на дно лунок в виде небольшого колечка с гладкими краями или «пуговки»
+ слабая интенсивность, для данной реакции характерны небольшие одиночные отложения на дне лунки. Неагглютинированные эритроциты образовывают «маленькое колечко» в центре лунки
++ средняя интенсивность, ей свойственно образование на дне лунки «широкого плотного кольца» из неагглютинированных эритроцитов
+++ интенсивная реакция, агглютинированные эритроциты образуют так называемые «зонтики», в центре которых, явно видны кольца, образованные осевшими неагглютинированными эритроцитами
++++ резко интенсивная реакция, в которой агглютинируются все эритроциты и, образуя «зонтики», выстилают дно лунок.
Титром данной реакции считают последнее разведение сыворотки, при котором выявляется явная агглютинация эритроцитов не менее +++, то есть при интенсивной или резко интенсивной реакции.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Принцип метода заключается в своеобразном взаимодействии антитела с антигеном. Одним из обязательных условий реакции является предварительная фиксация одного из её компонентов, то есть антигена или антитела, на твёрдых планшетах. Затем, при помощи ферментной метки обнаруживают возникнувшие комплексы антиген – антитело благодаря изменению оптической плотности первоначальной смеси (субстрата), что проявляется изменением интенсивности её окраски. ИФА свойственны некоторые преимущества перед остальными серологическими методами, например, данная реакция является наиболее чувствительной, в тестах используются универсальные реагенты, остающиеся стабильными не менее 6 месяцев, автоматизированный процесс учёта результатов реакции. Набор, необходимый для проведения реакции, содержит следующие компоненты: паразитарный антиген, специфические сывороточные антитела, конъюгат, планшета с зафиксированным на ней специфическим паразитарным антигеном, контрольные сыворотки.

Постановка реакции ИФА происходит в несколько этапов: вначале производится приготовление необходимых растворов, затем готовятся исследуемые образцы сывороток, а также контрольные сыворотки, позже следует нанесение приготовленных образцов сыворотки и контрольных сывороток на твёрдофазные носители, планшеты инкубируются, промываются и, только после проведённых процедур в лунки планшет вносится конъюгат. Через некоторое время он удаляется путём промывания лунок. На завершающем этапе в лунки вносится субстратная смесь и выдерживается в тёмном месте при комнатной температуре. Оценка результатов проводится автоматически при помощи специальных измерительных приборов, в некоторых случаях допускается визуальный учёт результатов проведённой реакции.

Достоверность и качество методов серологической диагностики зависят от организации проведённого внутреннего и внешнего лабораторного контроля, состоящих из нескольких независимых процедур, предназначенных для оценки качества результатов проведённого анализа.